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恒兴医药重磅推出——基于Caco-2模型的生物等效性豁免渗透性分类服务

来源:恒兴医药


一、BCS简介及其应用

BCS 分类系统由AMIDON等科学家于1995 年提出,将药物按照其水溶性和肠道渗透性分为4 类,以进行化合物口服吸收的预测:





在过去的几十年中,BCS分类系统得到了广泛的研究和实际应用。2000年以后,美国食品药品管理局(FDA)、欧洲药品管理局( EMA)、世界卫生组织(WHO)、中国国家药品监督管理局(NMPA)等都各自发布了基于BCS 分类的生物等效性豁免指导原则。这种基于BCS分类的生物等效性豁免思路,其基本逻辑是:药物的口服吸收取决于其在胃肠道的溶解性/溶出度以及渗透性,如果相同的活性成份在胃肠道环境中具有相同的浓度-时间曲线、且吸收过程以及渗透性不受到辅料的影响,那么其吸收程度和吸收速度也应相同,则该药物亦可无需通过临床试验以证明其体内生物等效性。因此,基于BCS分类的生物等效性豁免思路被认为是药物开发中一种节省大量成本和时间的可行方法。
尽管都基于相同的原理和大致的路线,各国/地区监管机构在其各自指导原则中的具体技术指南并不完全相同。因此,为了促进国际申请并整合不同的生物豁免标准,ICH(国际人用药品注册技术协调会)于2016年10月年开始组织编写关于生物等效性豁免申请的总括指南ICH M9,并于2019年11月发布了最终指导原则。目前,M9 指导原则已进入ICH 程序的第5 阶段,即实施阶段,在实施阶段中将由各ICH各成员国/成员机构按照各自的行政程序和步骤予以实施。我国国家药品监督管理局(NMPA)在2021年第61号公告(发布日期:4月28日)中明确了自该公告发布之日起6个月后开始的相关研究(以试验记录时间点为准),适用上述ICH指导原则。与M9最终版同时发布的问答文件对该指导原则中部分问题作了进一步说明,其中有大量笔墨是与Caco-2相关的论述和解释。

二、Caco-2在基于BCS分类的生物等效性豁免方法中的作用

Caco-2细胞系于20 世纪70 年代首次分离自人类结直肠癌细胞, 其模型最初是由Borchardt 和WorkeM在1989 年提出的。以普通的培养条件培养成熟的Caco-2细胞即可形成与小肠上皮细胞相同的细胞极性和致密的单细胞层组织,其形态和功能上与人体的小肠上皮细胞相似。成熟的Caco-2细胞在贴壁单层的状态下具有极化的顶端侧(apical side,对应于肠腔绒毛侧)和基底侧(basolateral side,对应于血管侧),可以作为药物分子透过小肠上皮细胞吸收入血的良好体外评价工具。近三四十年来,Caco-2细胞作为药物肠道吸收预测的模型已经得到极为广泛的研究、关注和应用。也因此,Caco-2成为了基于BCS分类的生物等效性豁免实践工作中对渗透性分级的重要工具。

当然,对于药物渗透性分级来讲,除了Caco-2模型外,研究界还有一些其他的工具包括离体肠囊外翻模型、在体肠灌流以及其他的单层细胞模型如MDCK等。我国NMPA于2016年05月18日发布的《人体生物等效性试验豁免指导原则》中提到了以上这些可能的模型,FDA指导原则中提到了包括Caco-2在内的“单层细胞模型(in vitro permeation studies across a monolayer of cultured epithelial cells)”,而EMA指导原则中则提到了更广泛而言的“良好的体外试验(Well performed in vitro investigations)”。

但值得注意的是,ICH生物等效性豁免指导原则中对于非人体试验系统的描述中,仅提到了Caco-2并进行了详细的实验体系设计和验证的说明。对此,与M9最终版同时发布的问答文件做出了解释,原文如下:

问:为何渗透性评价仅限于Caco-2细胞系?可否使用其他经充分验证的细胞系来评估BCS分类的渗透性,例如MDCKII、LLC-PK1?

答:普遍认为可以通过其他体外(其他细胞系,例如MDCKII)或原位(Loc-I-Gut)/离体(大鼠外翻肠囊模型)工具评估渗透性,但是,因为除美国FDA外,任何其他监管机构均尚未建立体外渗透性评价方法,因此先使用现有经验最多的方法。将来,当监管机构获得更多体外数据经验时,可考虑其他细胞系或动物离体和原位方法,但只限于根据当前指导原则草案附录I中所述原则进行严格验证和标准化的方法。


恒兴医药完全参照ICH M9中的具体实验要求及建议建立了基于Caco-2单层细胞模型的生物等效性豁免渗透性分类评价体系,并对建立的评价体系经过了充分和完整的验证,结果完全符合预期,可以达到清晰的“高渗透性-非高渗透性”二元分类目的并用于支持药物的生物等效性豁免申报。

在恒兴医药的验证工作中,我们根据ICH M9指导原则中所列明的模型化合物中选择了21种化合物,其中包括低(Fa < 50%)、中(50% < Fa < 85%)、高(Fa≥ 85%)渗透性模型化合物各至少5个、并包括一个零渗透化合物。对这些模型化合物,在两个不同的生理相关的pH值条件下测得其表观渗透系数(Papp),每一个模型化合物包含至少三次实验数据(每次实验数据包含三个平行的测试)。通过文献报道的体内吸收分数,我们建立了这些化合物与它们的表观渗透系数之间的良好相关性。通过作图以及公式拟合,我们可以实现化合物在体内吸收程度的良好预测,并且实现清晰的高渗透性药物的定性。需要注意的是:应用该预测系统的前提条件是,受试化合物不具有严重的转运体介导的事实和倾向。

验证结果如下图所示:


图1. 恒兴医药使用21种模型化合物的Caco-2试验表征结果。将顶端侧pH 6.5和基底侧pH 7.4或顶端侧pH 7.4和基底侧pH 7.4下获取的Papp(A-B)与人口服吸收数据(Fa)作图。画圈标记的即为中/高渗透性分级指标性化合物。

在恒兴医药的评价体系中,高渗透性化合物组别中的一个偏低的化合物A被确定为“中—高”渗透性定性分级指标性化合物,而低渗透性化合物组别中的一个偏高的化合物B则被确定为“低—中”渗透性定性分级指标性化合物(ICH M9指导原则中称这些定性分级指标性化合物为“分级内标”)。在渗透性定性分级评价中,将受试化合物与前述指定的指标性化合物进行平行实验,测得各自的表观渗透系数,通过相对高低的比较来实现渗透性高低的定性。实验的结果需落在指标性化合物可接受的数值范围内,以确保定性分级的可靠性。

四、恒兴医药Caco-2渗透性分级服务包

恒兴医药基于Caco-2的BCS渗透性分级研究服务包中,体系验证与受试物试验将分开进行。其中包括21个模型化合物的体系验证将保持一年有效期,而受试物试验将在有效期内开展。

受试物的渗透性实验将采用逐步试验法。其中,在第一步即预实验中,将在初步设定的一个或两个浓度下进行单向或双向(双向为优)表观渗透系数的测定,已初步证明受试化合物在Caco-2上的渗透性不依赖于初始药物浓度或不依赖于转运方向,由此初步确认化合物在受试浓度点上或受试浓度范围内为被动转运特性。在预实验中,同时将检测化合物在缓冲液中的溶解度、评估化合物在器材表面的吸附特性、评估化合物与单层细胞中成分的非特异性结合、单层细胞对化合物在测定浓度下的耐受性;预实验所获取的样品也将用来评估样品各种的浓度范围并开发出具有合适定量范围的生物分析方法。

在第一步预实验完成后,我们可能会进行一些实验条件的调整和优化(比如浓度的调整、解吸附剂的添加、分析方法的优化等),并开展第二步即确定性的实验。在确定性的实验中,我们将设定完整的三个浓度、并开展所有浓度下的双向渗透性实验。确定性的实验完成后,我们将获取完整的数据并根据监管标准准备完全的报告(包括体系验证报告和受试物试验报告)。所有的验证和受试物试验中,都将设置完整的质控对照组。所有实验的完成将处于恒兴专业的质量保证单元(QA Unit)及质量控制单元(QC Unit)监管和控制下。所涉及到的关键试验元素如下表所示:



表1. 恒兴医药用于BCS渗透性分级研究服务包元素的简短描述

五、讨论:基于Caco-2渗透性分级实验的重要考虑因素




化合物除渗透性以外的一些不良特性,如有限的水溶性、与塑料表面和/或细胞成分的非特异性结合、细胞毒性作用等,如果不及早进行识别和考虑,可能会明显影响到其测得的表观渗透系数的可靠性,并因此影响到其最终渗透性定性结果的准确性。因此,恒兴的成套服务中将包括一系列必需的支持性实验内容,针对这些可能的不良特性进行考察和评估,用以辅助建立最优的渗透性测试条件。


1)溶解度、吸附性及回收率的考虑

受试化合物所设定的测试浓度如果超出其在缓冲液介质中的溶解度极限,将导致化合物析出而使化合物在Donor面的真实浓度小于理论浓度,最终将低估化合物真实的渗透性;同时,化合物在Donor面的析出将会直接影响到试验后的物质回收率。受试化合物如果和塑料表面以及细胞成分具有较强的非特异性结合,将导致化合物在Donor和Receiver面的真实浓度均小于理论浓度,同样会影响到物质回收率,但对渗透性测定的影响将更加无法预计。

在物质回收率较低的情况下,渗透性数据需要被小心地解读和使用。M9指导原则提出:对于回收率<80%的情况,应进行物质平衡评价,包括测定细胞单层和试验装置上的药物残留量。在物质回收率相当低的情况下,通常会认为渗透性数据的可靠性存在较大的问题。这种情况下,可能需要采取一些必要的措施以提高回收率,比如增溶剂和解吸附剂的使用。但我们需要知道,这些措施可能会导致化合物的测得渗透性高于其真实渗透性,最终的结果仍然需要被小心地解读和使用。

2)细胞毒性的考虑

如果受试化合物对试验系统中的Caco-2细胞有毒性作用,则单层细胞的致密性可能受损,并且会检测到所有标记物的整体更高的渗透性。而单层细胞致密性受损的情况下,渗透性数据显然不能用于分类。为了实现更可信的渗透性分级,我们可能不得不将化合物浓度调整到合适的更低的浓度来获取更可靠的渗透性数据。

3)生理pH值的考虑

许多药物在Caco-2 单层细胞模型中的渗透性易受pH 值的影响。为了尽量减少假阴性结果的出现(即将非低渗透性药物归类为低渗透性药物),我们将设置两个不同的顶端侧pH值(即pH 6.5及7.4),以更好地模拟肠道中的动态pH 值环境。在这两个设定的pH 值条件下测得的渗透性,将有助于更完整可靠地评估受试化合物的渗透性及其分级。我们的测试体系验证中,也已经分别对所有模型化合物测定了这两个pH值条件下的渗透性,结果显示均能实现良好的吸收预测和渗透性分级。

4)转运体功能的考虑

有关体外渗透系统中转运蛋白活性和功能的信息至关重要,并且一直在对生物等效性豁免提交的监管反馈中得到重视和强调。因此,作为我们BCS渗透性分级研究的一部分,应用了一套对照来确认外排转运蛋白在Caco-2测试系统中的功能:在存在和不存在对照抑制剂的情况下,P-gp和BCRP特异性底物的外排比率具有明显的变化即能证明测试系统中外排转运蛋白的充分表达和活性。对受试化合物来讲,需要证实其在转运过程中不存在主动转运机制。通常通过以下两种方式之一或结合起来进行判断:1)在不同的测试浓度下,从顶端侧到基底侧的表观渗透系数不发生明显变化(即浓度非依赖性的渗透性表现);2)外排比率小于2。在恒兴的测试方案中,我们推荐在所有的3个测试浓度下均进行双向表观渗透系数的测定后,综合运用以上两个标准进行评判以获得更充分的证据。

5)实验质量的保证

目前全球各国/地区的监管实践下,对于除安全性评价以外的所有申报性非临床研究,并未要求遵循GLP规范。对于此类原则上为Non-GLP的申报性研究,恒兴医药都默认以GLP-Like的标准来要求。所有实验都在恒兴专业的质量保证单元(QA Unit)及质量控制单元(QC Unit)监管和控制下完成。我们在人、机、料、法、环、测等各方面都严格控制,保证数据生成的真实性、完整性和可溯源性,以确保实验在质量和技术要求上都满足中外所有监管要求。

恒兴医药基于Caco-2模型的生物等效性豁免渗透性分类研究的方法验证和受试物测试的最终验证报告包含以下完整的信息:研究编号/标题、研究场所、研究日期、原始资料存储信息、模型化合物/受试物/定量内标/指标性化合物的名称/来源/含量纯度信息、生物分析方法细节、药物(指标性化合物及受试物)双向渗透Papp值/回收率/外排比等信息。此外,还应包括建模所使用的模型化合物及人体吸收程度数据、数学模型等,这些完整的信息有利于申请人进行规范化的研究数据呈现与申报,支持相关监管部门的审批。

作者 | 恒兴医药科学家团队






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